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蛋白质含量测定法

浏览:11 发表时间:2020-06-19 00:00:00

蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。


值得注意的是,这四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。


folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰lowry反应,而且对后者的影响还要大得多。考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用. 索莱宝公司提供的Bradford 蛋白浓度测定试剂盒可以用于蛋白质含量测定,简单快速。


产品简介: 

  考马斯亮兰G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(Imax),由 465nm变为 595nm,在一定的浓度范围内,测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,样品中巯基乙醇的浓度可高达 1M,二硫苏糖醇的浓度可高达 5mM,但受略高浓度的去垢剂影响,需确保SDS的浓度低于0.1%,Triton X-100低于0.1%,Tween 20, 60, 80 低于0.06%。


操作说明: 

一.微孔酶标仪法 

 1.完全溶解蛋白标准品,取 10ul,稀释至250ul,使终浓度为0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见,也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。 

 2.5×G250 染色液使用前请颠倒3-5次混匀,取1ml 5×G250染色液,加入4ml双蒸水,混匀成1×G250染色液,此1×G250染色液可在4℃保存一周。 

 3.将标准品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分别加到96孔板中,加PBS稀释液补足到20微升。 

 4.将样品作适当稀释(最好多做几个梯度,如作2倍、4倍、8倍稀释),加20微升到96孔板的样品孔

中。由于移液器在取小量时的误差,标准线前面的点可能不很准确,所以尽可能的让样品点落在标准线1/2 后。  

 5.各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液,室温放置3-5分钟。 

 6.用酶标仪测定A595,或560-610nm之间的其它波长的吸光度。 

 7.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。 

二.分光光度计法 

  如无酶标仪,染色反应可在离心管中进行,反应液混匀后加入比色皿中,使用分光光度计测定吸光值。 


步骤如下: 

1.取八支(或者更多)干净的 10ml 离心管,标记上号。 

2.取100ulBSA加入PBS 2.4ml 稀释至终浓度为 0.2mg/ml。 

3.5×G250 染色液使用前请颠倒 3-5 次混匀,取 10ml 5×G250 染色液,加入 40ml 双蒸水,混匀成 1×G250 染色液,此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 

4.按下表加入试剂(以每孔 5ml 计,多余的用来清洗比色皿) 

离心管号1、2 、3、4、5、6、7(样品管1)、8(样品管2)、9(样品管3)

标准蛋白 BSA  0ul  100ul  200ul  300ul 400ul 500ul 500ul 适当稀

释的样品 1 

500ul 适当稀

释的样品 2 

…… 

PBS  500ul  400ul  300ul  200ul 100ul 0ul  0ul  0ul   0ul 

1XG250 染色液  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml 

5. 反应3分钟后测OD值。为了实验的准确性,可每间隔2分钟加一管染色液,每间隔2分钟测一管 OD

值。如下表: 

离心管号  1  2  3  4  5  6  7  8  …… 

加染色液(分钟)  0  2  4  6  8  10  12  14  …… 

测 OD值  3  5  7  9  11  13  15  17  …… 

考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。


素材来源于网络。

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