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荧光定量 PCR 方法:探针法 VS 染料法?

浏览:16 发表时间:2020-03-19 00:00:00

荧光定量 PCR 又称 qPCR,是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量 PCR 荧光为基础对核酸进行定量分析,其应用非常广泛,可以用于检测基因的表达量(RNA 的丰度),验证表达谱芯片或转录组测序的数据,确定病原体的载量,对片段的拷贝数(CNV)进行分析,对基因进行分型等等。


大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定,其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化,记录检测荧光达到阈值时的循环数(Ct 值)。从理论上说,起始模板量和 Ct 值密切相关,因此我们通过判读 Ct 值从而对样本进行定量。


在进行荧光定量 PCR 时,从技术和产品来说,我们往往会有许多选择,尤其是方法的选择,对最终结果的准确性至关重要。荧光定量 PCR 从方法上来说可以分为染料法和探针法两种。


一、染料法

在国内,染料法一般采用 DNA 染料 SYBRGreenⅠ,染料法使用简单,成本也相对较低,因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧光定量 PCR 实验中,染料能够与双链结合,从而发光,而在游离状态下,SYBR Green I 发出微弱的荧光。所以,一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链 DNA 量呈比列,且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链 DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现,会极大的影响真实结果的准确性。为此,一些厂商提供 ROX 作为内部荧光参考标准,用来校正背景,但是即便如此,染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段,对于复杂序列,如果难以扩增的话,也会受到脱靶效应(如引物二聚体)的影响。在这种情况下,就需要在实验前期进行熔解曲线分析,判断扩增所得产物是否只有一种。


二、TaqMan 探针法

TaqMan 探针法 PCR 扩增时,在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。Taqman 探针为一段线性的寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团(FAM 或 Hex 等)和一个荧光淬灭基团,当探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR 仪检测不到荧光信号;当 PCR 扩增时(在延伸阶段),Taq 酶的 5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步,这也就是探针法定量的原理。


三、区别

探针法与染料法的最大区别在于,理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列,也就是不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。除此之外,人们还可以利用不同探针,在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标,达到节省实验成本的目的。在样本量比较大的情况下,成本甚至可以低于染料法。

因此我们可以看到,在选择荧光定量实验时,探针法在特异性和准确性方面远远优于廉价的染料法,但在实际使用时,TaqMan 探针高昂的价格常常让人望而却步。


素材来源于网络。

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