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重组表达蛋白纯化后为什么会发生沉淀?如何避免发生沉淀?

浏览:13 发表时间:2020-02-21 00:00:00

重组表达蛋白纯化后发生沉淀,这种情况一般发生在镍离子亲和纯化蛋白中发生的最多,纯化后的蛋白发生沉淀主要有这么几种原因:

第一:在Ni纯化的过程中,有一部分镍离子会脱落,脱落的镍离子属于重金属,会对蛋白的凝集和沉积起到一定的作用;

第二:我们人为人工制造的这种溶液环境,不一定真正符合蛋白本身的“生存”的环境要求,所以要从离子浓度和pH去考虑,特别是盐离子浓度;

第三:找准蛋白质的一个等电点,溶液环境的ph值不能在蛋白质等电点的附近,如果在等电点的附近的时候,这个时候蛋白非常容易沉淀;

第四:蛋白反复冻溶,过程中生成的一些小冰晶会对这个蛋白的结构造成一定的伤害,离子和缓冲液状态发生较大变化;

第五:如果长时间放在4度的情况之下蛋白质,容易滋生微生物,微生物的生长的可能造成蛋白的性质变化或者降解也容易产生一些聚集沉淀。

 

是不是沉淀的蛋白就一定完全失去了结构活性呢?这个是不一定的,我们曾经做过这样一个案例,一个红色荧光蛋白表达。放在4度放了一周,很多的蛋白都沉淀下来了,但是沉淀物依然是红色的,这个案例说明了至少这个蛋白,蛋白质沉淀后只是部分失活或者结构变性。如何让便面和解决重组蛋白纯化后聚集沉淀呢?


湖南韵邦提出以下几个建议:

1.我们建议如果用镍柱来纯化蛋白的时候,纯化的过程纯化之后的溶液当中适当的加一点EDTA,让它螯合脱落下来的镍离子,减少重金属对蛋白的伤害。

2.我们可以加点分散剂,避免蛋白质分子接触碰撞,减少它的聚集,这些分散剂,比如说甘油,聚乙二醇,甘露醇,还有这个山梨醇之类的。

3.我这个蛋白的话允许你加入一些辅助性的保护蛋白的话,那是最好比如说这个白蛋白。

4.可以加一点个氨基酸,比如说精氨酸。

5.准确的算出蛋白质的pI等电点,算等电点是要把整个蛋白包括融合的部分都代入计算,包括载体上的人和蛋白,所以这样才能算出一个准确的等电点,溶液的环境的pH值,要避免在等电点附近。

6.一个蛋白有些蛋白比较娇贵,有些蛋白比较皮实,在这过程中的话,我们还要避免蛋白的一些热损伤。

7.很多的蛋白的话,它独立的时候是很难存在的,它必须有一些辅助的离子或者辅助的一些蛋白,它才能够一个很好的维持一个很好的一个构象,所以必要的时候添加它的一些辅助的蛋白或者是因子。

8.每个蛋白的情况都不一样,也许你在处理其他蛋白的时候都很好,但是处理这个蛋白的时候情况完全不一样,这就是为什么呢?我们研究的这些蛋白,有时候没有一招鲜或者是通用方案;我们曾遇过这样的一个案例,某个寄生虫体内的一个酶,我们表达的时候,它可以得到上清表达非常好,我们对其中的一个氨基酸进行突变,它立马从上清表达状态变到包涵体表达状态;从这个地方我们是否可以通过加减氨基酸为蛋白质”改命“(改性)。

 

素材来源于网络。

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